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银杏叶中银杏内酯A分离纯化工艺研究 银杏叶工艺品

・实验与应用・

2011#-935卷97期第318页

318

药学进展

2011,V01.35。No.7

银杏叶中银杏内酯A分离纯化工艺研究

郭瑞峰1’2,

屈凌波1,

陈代杰2,

李继安¨,

阚士东2,

林惠敏2

(1.河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001;2.上海医药工业研究院创新药物和制药工艺

国家重点实验室,上海200040)

【摘要】目的:建立一种简易的白银杏叶中提取、分离和纯化银杏内酯A的方法。方法:依次通过乙醇溶液搅拌提

取、乙酸乙酯萃取、大孔树脂吸附与洗脱及结晶和重结晶对银杏叶中的银杏内酯A进行分离纯化。以银杏内酯A的得率和纯度为指标,对银杏内酯A的分离纯化工艺进行优选。结果:确定银杏内酯A提取、分离和纯化的最佳工艺条件为:将银杏叶乙醇提取物混悬液的酸碱液调节至pH3后进行萃取;选择NM100树脂为固定相,萃取物溶液调节至pH3后上柱,流速控制为1mL・min~,再以体积分数为30%和50%的乙醇溶液进行梯度洗脱;收集50%乙醇洗脱液,浓缩后4℃下静置过夜,得粗晶体并进行重结晶,体系中乙醇与水的体积比为2:l。该工艺制得的银杏内酯A晶体纯度高于99%,总收率约为60%。结论:该工艺稳定、简便易行,适合工业化大生产。

【关键词】银杏内酯A;分离纯化;大孔吸附树脂;结晶

【文献标志码】

【中图分类号】R282.71;。I'Q028【文章编号】1001-5094(2011)07-0318一05

Study

on

IsolationandPurificationofGinkgolideA

frOmGinkgoLeaves

GUORui.fen91”,QuLing.b01,CHENDai-jie2,LIJi-肌2,KANShi-don92,LINHui—rain2(1。SchoolofBioengineering。HenanUnivers豇yofTechnology,Zkngzhou450001,China;2.StateKey

Laboratory

ofShanghai

Institute

ofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200040,China)

【Abstract]Objective:Toestablish

fromginkgo

simplemethodofextraction,isolationandpurificationforgiI:dcgolideA

Ainginkgoleaveswasextracted。isolatedandpurifiedby

leaves.Methods:ne#rlkgo]ide

extractingwithalcoh01.watersolutionandethylacetate,bymaeroporousresin’8adsorptionandelution,aswell

as

bycrystallizationandrecrystallization.弧eoptimumconditionsoftheprocesswerestudiedbytaking

con-

theyieldandpurityofginkgoliaeA够index.Results:’11leoptimumconditionsoftheprocesswere

finned

as

foilOWS-"thepHvalueofethanolexh-aetfromginkgoleavesWSS

acetateextnletWaS

adjusted

tO

3beforeextractionwith

ethylacetate;thepHvalueofethyl

adiusted

tO

3andthenNMl00maeroporousresinwas

usedtoadsorbtheethylacetateextract.withtheflowrateofImL・mill。;Thecolulnnwaselutedwith

30%and50%ethanolrespectively.andthenthe50%ethanoleluantw鹪collectedandconcentrated;

[接受日期】2011-03-04

【项目资助】。重大新药创制”科技重大专项

(No.2009ZX09301-007)

。通讯作者:李继安。研究员;研究方向:微生物药物学;

Tel:021.84399808-704;E-mall:lijimnhecmn@126.tom

万方数据

2011,go/.35,No.7

319

Progress跏PharnmceuHcalSciences

药学进展

at

・实验与应用・

201lq-第35卷第7期第319页

The50%ethanol

water

ehantw鹪crystallized4℃,andthenthemacrocrystal

WaS

recrystallizedinethanol-

systemwiththeratioof2:1.ThepurityoftheginkgolideApreparedinthisprocesswasabove

can

99%.withtheyieldof60%.Conclusion:Theprocessisstableandfeasible.It

trialproduction.

beapplied

to

indus・

【Keywords]ginkgolideA;isolationandpurification;nutcroporousresin;crystallization

银杏内酯(ginkgolide)类化合物主要包括银杏

内酯A、B、C、J、M和白果内酯(bilobalide)等…,均activating

factor,PAr)的

中枢神经系统具有保护作用,此外还有抗焦虑、抗过

晒干银杏叶(购自山东省郯城县国奥银杏苗

(美国罗门哈斯公司)、HZ・816大孔树脂、微球l号万方数据

I.2仪器

Agilent

1200型高效液相色谱仪,色谱柱型号为

Agilenteclipseplus

C18(4.6

mm×250nlm,5

Ixm);

R-200型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);J25型低温

高速离心机(美国Beckman公司)。

2方法2.1色谱条件

参照文献[8],选定的色谱条件如下,流动相:甲醇一翟氢呋喃一水(体积比为20:10:70);流速:

mL・min~;进样量:10止;柱温:40℃;检测波

长:225衄。

2.2银杏内酯A标准曲线制备

按“2.1”项下色谱条件,参照文献[8]中方法,

制备银杏内酯A对照品乙醇溶液标准曲线。2.3银杏叶醇提物的制备及测定

取晒干银杏叶3.15kg,水洗后加入体积分数为60%的乙醇15.5L,70℃下搅拌提取2h,离心(500r・min。1)5min,取上清液。上述步骤重复

2次。合并上清液,35℃下减压浓缩至提取液无

醇味,即得银杏叶醇提物混悬液。取混悬液

10

mL,45℃下减压浓缩至干,加入无水乙醇1

mL

溶解,经孔径为0.22pan的尼龙膜过滤,滤液进样,测定醇提物混悬液中银杏内酯A的含量。

2.4银杏内酯粗提物的制备及测定

取银杏叶醇提物混悬液8份,每份50mL,用

盐酸分别调节其pH值为2—8,加入乙酸乙酯

50mL萃取,观察萃取分层效果。取乙酸乙酯相10

mL,待溶剂完全挥干后,加入无水乙醇lmL溶

解,经孔径为0.22斗m的尼龙膜过滤,滤液进样,测定银杏内酯A的含量,并根据“2.3”项下测得的银杏叶醇提物混悬液中银杏内酯A含量,计算乙

酸乙酯萃取率,以考察pH对萃取效果的影响。按最适pH条件用乙酸乙酯对醇提物混悬液进行萃取,并于30℃下将乙酸乙酯相低压浓缩至干,得到

为血小板活化因子(platelet

强效拮抗剂,对心脑血管和神经系统方面的疾病均有较好治疗作用幢J。银杏内酯A(1)对缺血损伤和敏、抗休克及抗器官移植排斥反应等功能¨J,故而其单体的分离纯化具有重要意义。但是,银杏内酯类化合物中各单体结构相近,分离极为困难。目前

文献报道的银杏内酯A单体的制备工艺主要是先

采用多级萃取法结合大孔树脂吸附法或硅胶一活性炭吸附法从银杏叶中提取银杏总内酯mJ,再采用

超临界流体萃取一重结晶法或制备色谱分离一超临

界CO:萃取结晶法得到银杏内酯A单体M】。然而,上述方法工序复杂,成本较高,不适于工业化大

生产。笔者所在课题组将溶剂萃取、柱色谱分离和结晶技术结合起来,成功开发出一种程序简单、成本较低且稳定可靠的银杏内酯A分离纯化工艺,本文对此予以详细介绍。

1材料

1.1药材、树脂和试剂

木基地);4种树脂型号分别为:XAD-2大孔树脂(Microsphere.1)大孔树脂(上海华震树脂公司)和NMl00(苏州纳微生物科技有限公司);银杏内酯A

对照品(批号为E-O007,纯度为99.0%,上海同田生物技术有限公司);甲醇和四氢呋喃为色谱纯,其他试剂均为分析纯,均购自国药集团化学试剂有限公司。

・实验与应用・

2011年935卷第7期第320页银杏内酯粗提物浸膏。

2.5银杏内酯A的吸附与洗脱

320

2011,VoL35,No.7

药学进展

ProgressinPharmaceuticalSciences

倍树脂体积、不同体积分数的乙醇溶液进行梯度洗

脱,考察洗脱液(体积分数分别为20%、30%、

40%、50%、60%、70%和90%的乙醇溶液)对分离效果的影响。上样和洗脱均采用虹吸法,通过数

2.5.1大孔吸附树脂的筛选取预处理的XAD-2、

Hz.816、微球l号及NMl00等4种湿树脂各5g,精密称定,置于750mL三角瓶中。取“2.4”项下制备的银杏内酯粗提物浸膏lOg,加无水乙醇100mL溶解,再加蒸馏水至溶液总体积为l

000

控计滴自动部分收集器定量收集洗脱馏分,每瓶收

集10mL,进样,测定各洗脱馏分中银杏内酯A的含量。选择最优的吸附与洗脱条件后进行扩大试验。2.6结晶和重结晶

mL,混匀,进

样,测得银杏内酯A浓度为8.72g・L~。将上述溶

液均分为4份,分别加入上述4个装有不同树脂的

三角瓶中,室温下振荡(250r・min。1)3h,取上清液,进样,测定银杏内酯A含量;树脂经过滤除去滤液后,加入蒸馏水50mL洗涤,再次过滤除去滤液,加入90%乙醇溶液400mL,振荡(250r・rain。1)

根据银杏内酯A在乙醇和水中溶解度差异较大的原理,选用乙醇一水系统对银杏内酯A进行结

晶和重结晶。将50%乙醇洗脱液在25℃下减压浓缩直至出现少量浑浊,然后置于4℃冰箱中静置过夜(约8h)使之充分析出结晶。将所得银杏内酯A粗晶体抽滤,蒸馏水洗1次,再用少量无水乙醇溶解,得到浓度约为0.5g・mL。1的溶液,平行5份,然后置于4℃冰箱中静置,待出现少量浑浊时分别加

h。取上清液,进样,测定银杏内酯A含量。树脂在室温下对银杏内酯A的吸附量和解吸

率计算公式如下:

吸附量=(c0-C)×V/m

入不同体积的蒸馏水,至乙醇溶液与蒸馏水体积比

分别为4:l、3:l、2:1、1:1和1:2,再置于4oC冰箱中静置过夜,即得银杏内酯A晶体。通过得率和纯度测定,选择最优的乙醇溶液-蒸馏水比例。3结果

3.1银杏叶醇提物混悬液pH的确定

解吸率=[KCl/(co—c)明×100%

其中c0和C分别为树脂吸附前后银杏内酯粗

提物醇溶液中银杏内酯A的浓度,C。为90%乙醇解吸附后溶液中银杏内酯A的浓度;V为银杏内酯粗提物醇溶液的体积(250mL),K为洗脱液体积(400mL);m为湿树脂质量(5g)。

2.5.2动态吸附及洗脱条件优化选择吸附和解吸综合效果最优的树脂,以70%一80%乙醇溶液

浸泡12小时后,用蒸馏水洗涤至无醇味,取5g装填于20

20

mm×200

萃取试验结果显示,银杏叶醇提物混悬液pH为2和3时,萃取液分层迅速;pH为4—8时,萃取过程中发生乳化现象,且随pH值上升乳化程度越

来越严重,直至难以分层;对萃取后的酯相与水相中银杏内酯A含量进行检测后可知,混悬液pH为3

mm的层析柱中(树脂体积约为

mL)。取“2.5.1”项下方法制备的银杏内酯粗提

物乙醇水溶液200mL作为上柱液。选择不同上柱液pH值(2、3、4、5和6)及其流速(O.5、L0和

1.5

时,乙酸乙酯萃取效率最高,等体积萃取2次即可将

超过99%的银杏内酯A萃取到乙酸乙酯相中(见

mL・min。1),考察其对动态吸附效果的影响;

表1)。因此,萃取前将银杏叶醇提物混悬液pH调

至3为宜。

上样完毕后,水洗树脂至流出液无色,然后分别用4

表1银杏叶醇提物混悬液pH对萃取效果的影响

Tablel

Theinfluence

0fpHValucofalcohdextrac协suspensionfromOnkgoleav∞onextractioneffecl

3.2树脂的选择

XAD-2、Microsphere.1、HZSl6和NM100这4种树

银杏内酯A的静态吸附与洗脱实验结果显示,脂对银杏内酯A的吸附量分别为42.83、38.69、

万方数据

2011,V01.35,No.7・321

inPharmaceuticalSciences

药学进展

・实验与应用・

Progress26.93和49.87mg・g~,解吸率分别为93.7%、89.9%、87.6%和92.3%,其中NM100树脂对银杏内酯A吸附量最高,解吸率略低于XAD-2。因此,选用NM100树脂进行动态吸附和解吸实验。

3.3

NMl00树脂吸附及洗脱条件优化

3.3.1吸附条件的确定

考察上柱液pH分别为

2、3、4、5和6时,NM100树脂对银杏内酯A的吸附效果,结果显示,上柱液pH为3时,NM100树脂吸附率最大,可达84%(见图1)。

IOO

蔷68。0

莲40督20

}|

;日

目囵

45

pH

图1上柱液pH对银杏内醋A吸附效果的影响

Figure1

Theird]uenceofsamplepH

on

theadsorption

for

81nkgolldeA

此外,上柱液流速可明显影响NMl00树脂对内酯类化合物的吸附能力。实验显示,上柱液流速为0.5mL・min。1时,树脂吸附力较大,洗脱液接

收至第13瓶时方检测到银杏内酯A;随着上柱液流速增加,树脂吸附能力也逐渐降低,当流速为

L5

mL・min“时,洗脱液接至第8瓶时即检测到银

杏内酯A(见图2)。综合考虑树脂吸附效果与工作效率,选择上柱液流速为1.0

孰兰曼么.

mL・mill~。

辩L————《鲁主

3.3.2洗脱液浓度的选择

动态吸附及洗脱实验

结果显示,乙醇体积分数为20%和30%时,洗脱液中未检测到银杏内酯A;乙醇体积分数为40%时,洗脱液中才检测到少量银杏内酯A(含量为上柱液

万方数据

2011年第35卷第7期

第321页

中银杏内酯A的4%);乙醇体积分数为50%时,可

将大部分银杏内酯A从树脂上洗脱下来,洗脱液中银杏内酯A含量为上柱液中银杏内酯A含量的

94%;用60%乙醇进行洗脱时,可将残留在树脂上

的少量银杏内酯A(2%)洗脱下来。因此,洗脱过程中选用4倍树脂量的30%乙醇洗去色素杂质,再用4倍树脂量的50%乙醇洗脱银杏内酯A。经检测可知,用NM100树脂分离所得银杏内酯A的纯

度约为91%,将其再次通过树脂层析,未见纯度明

显增加,表明经该树脂1次层析即可完成对银杏内酯A的纯化。

3.4结晶及重结晶条件的确定

50%乙醇洗脱液浓缩后,置于4℃冰箱中静置

过夜,即得银杏内酯A粗晶。经检测,所得粗晶银杏内酯A的纯度约95%;在不同体积比的乙醇一蒸馏水体系中重结晶后,银杏内酯A得率和纯度各不

相同,其中,乙醇与蒸馏水体积比为2:1时,结晶速

度快,且收率与纯度较高(见表2)。因此,选择2:l

的乙醇-水系统用于重结晶。按照优化后的工艺进

行分离提纯,平行5组,每组银杏叶质量均为

3.15

kg,结果显示,所得银杏内酯A晶体平均质量

为(7.7±O.5)g,平均总收率为(61.1±0.3)%。

表2不同比例的乙醇-水对银杏内酯A重结晶得率及晶体纯度的影响

Table2

Theinfluenceofdifferentalcoh01.waterratios

on

the

yieldandpurityofginkgolideAinitsrecrystalllzation

3.5结构确证及纯度测定

本实验所得重结晶银杏内酯A经HPLC法鉴定,其出峰时间与对照品完全一致(见图3);经LC-MS分析显示,质谱图上出现m/z为409(M+H)、

431(M+Na)、447(M+K)和817(2M+H)的特征峰,表明待测样品分子质量确为408,此外,还出现

m/z为57的叔丁基特征峰,与银杏内酯A对照品完

全一致。

・实验与应用・

2011年第35卷97期・第322页

322

2011,V01.35,No.7

药学进履

ProgressinPharmaceuticalSciences

140120。

loo●

80●

60●

40●

20●

0●

10

12

14

16

18

t/rain

140120100

暑器

40200

t/min

A:银杏内酯A对照品;B:银杏内酯A重结晶样品

图3银杏内酯A对照品和重结晶样品的色谱图

Figure3.11地HPLCchromatognundreferencesubstanceandrecrystallization

product

of

gin蛔olide

本实验结果显示,银杏叶醇提物混悬液在用乙酸乙酯萃取前或乙酸乙酯提取物在上柱前,将其pH

调节为酸性有利于萃取或树脂吸附。这可能是因为

结构发生水解开环,生成极性较大的水溶性产物,从而明显降低银杏内酯A在乙酸乙酯中的溶解度以100对银杏内酯A的吸附效果。

在文献报道的基础上,本实验经工艺优化,最终g・L~、pH为3的萃取物乙

万方数据

醇-水溶液(乙醇:水=l:9),然后以NM100树脂吸

附,再以体积分数为30%和50%的乙醇溶液进行

梯度洗脱,流速控制为lmL・min~,收集50%乙醇

洗脱液,浓缩后置于4℃冰箱中静置过夜,所得粗晶

体水洗后用少量无水乙醇溶解,置于4℃冰箱中静

置。待出现少量浑浊时加人体积为粗晶体乙醇溶液1/2的蒸馏水,再置于4℃冰箱中静置过夜,即可。

采用此工艺所得银杏内酯A的转移率较高。且实

的得率和纯度均较为理想。【参考文献】【1]

VanBeekT

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究[D].北京:中国协和医科大学,1997.

验室放大研究及工厂中试生产实践结果均表明。此

工艺简单,放大适应性较好,成本低廉,银杏内酯A4讨论

银杏内酯A分子中存在内酯键,在碱性条件下内酯及非极性树脂NM确定了从银杏叶中提取、分离和纯化银杏内酯A的最佳工艺:银杏叶用60%乙醇提取2次,提取液浓缩后调节pH为3,经等体积乙酸乙酯萃取2次,所得萃取物制成浓度为10

银杏叶中银杏内酯A分离纯化工艺研究

作者:作者单位:

郭瑞峰, 屈凌波, 陈代杰, 李继安, 阚士东, 林惠敏, GUO Rui-feng, QU Ling-bo, CHEN Dai-jie, Li Ji-an, KAN Shi-dong, LIN Hui-min

郭瑞峰,GUO Rui-feng(河南工业大学生物工程学院,河南,郑州450001;上海医药工业研究院创新药物和制药工艺国家重点实验室,上海,200040), 屈凌波,QU Ling-bo(河南工业大学生物工程学院,河南,郑州450001), 陈代杰,李继安,阚士东,林惠敏,CHEN Dai-jie,Li Ji-an,KAN Shi-dong,LIN Hui-min(上海医药工业研究院创新药物和制药工艺国家重点实验室,上海,200040)

药学进展

PROGRESS IN PHARMACEUTICAL SCIENCES2011,35(7)

刊名:英文刊名:年,卷(期):

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